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通过钠钾比调控灌流培养CHO细胞的生长与表达

发布时间2019-09-12        浏览次数:99

    灌流培养通常需要连续或间断性地移除部分培养液以保持细胞密度恒定,这会造成培养基的浪费和产物回收率的降低。因此,保持细胞密度恒定的同时减少培养基的浪费就显得尤为重要。
    研究表明,细胞生长和产物比生成速率受到细胞周期的影响。而且,把细胞周期阻滞在G1末期可以显著抑制细胞生长和提高产物比生成速率。另有研究称,降低培养基的钠钾比可以显著抑制细胞生长和提高产物比生成速率。
    因此,本文研究了钠钾比在0.3至40的培养基对细胞生长和产物比生成速率的影响,发现低钠钾比对细胞生长和产物比生成速率有显著影响。研究发现,在低钠钾比条件下,胞内钙离子浓度显著减少,大部分细胞被阻滞在G0/1期。同时,不同细胞株在灌流反应器中也能达到相同的效果。
    综上,本文开发了一种通过调节培养基钠钾比来控制细胞生长和产物比生成速率的新方法,并对机理进行了深入的探究。zui终达到了维持细胞密度恒定和减少培养基消耗的目的。
    1、实验过程和方法
    本文所涉及到的实验流程和使用的方法如下表所示:
    24DWP:细胞培养在24深孔板中,接种时细胞密度为20×106 cell/ml。随后,将深孔板放置在33 ℃,5%二氧化碳,80%湿度,200 rpm的摇床中继续培养。每天更换三分之二体积的新鲜培养基。
3L生物反应器:细胞培养在钠钾比为9的培养基中,待细胞密度提高到目标值,即根据不同的实验条件更换不同钠钾比的培养基。对不同的细胞株,zui小灌流速率稳定在0.3~0.8 nl/cell/day。
    2、实验结果
    实验一
    本小节研究了不同钠钾浓度对深孔板中细胞生长和产物比生成速率的影响。为了防止渗透压的变化对细胞生长造成影响,在保持钠钾比不变的基础上,尽可能通过调节培养基组分保持渗透压在375 ± 15 mOsmol/kg范围内。
    由Figure 1a可知,在低钠钾比培养基中,细胞生长较慢。在不同实验条件下,细胞活率都在85%以上,说明活细胞密度的差异不是由死细胞造成的,而是因为细胞生长受到了阻滞。细胞的比生长速率和产物比生成速率都换算成钠钾比为2培养基中参数的倍数。
    Figure 1b表示不同钠钾浓度条件下,预测值的等值线图。结果表明,细胞比生长速率受钾离子浓度显著影响。较高的钾离子浓度会导致较低的细胞比生长速率。反之,钠离子浓度对细胞比生长速率的影响则不显著。同时,产物的比生成速率受到钠离子浓度和钾离子浓度的共同影响。zui终,在钠钾比为0.5的培养基中,细胞比生长速率较低,产物比生成速率较高,为zui优的培养条件。
    实验二
    有研究表明,钠钾离子浓度的改变会导致细胞膜电位的改变,进而影响胞内钙离子浓度。胞内钙离子浓度的改变则会对细胞生长产生显著影响(Bi et al., 2013; Monteith, Davis, & Roberts-Thomson, 2012)。本小节研究了在钠钾比为2的培养基中,胞内钙离子浓度的变化。CAI为钙离子通道抑制剂,本节实验被用来抑制胞内钙离子浓度。结果如Figure 2所示。
由Figure 2a可知,在培养基钠钾比为0.5的条件下,大部分细胞胞内钙离子浓度较低,说明在低钠钾比的培养基中,胞内钙离子浓度受到抑制。
    由Figure 2b可知,在钠钾比为2的培养基中单独加入CAI,经过3天的培养,可以发现细胞生长受到了显著的抑制,但是细胞活率却没有明显的改变。
    由Figure 2c可知,对比培养基钠钾比为0.5和加入CAI两种条件,细胞平均比生长速率有显著差异,但是产物平均比生成速率没有显著差异,说明培养基钠钾比为0.5的条件对细胞影响更显著。但是,在培养基加入CAI的条件下,细胞平均比生长速率和平均产物比生成速率相较于高钠钾比条件皆有显著改变,说明胞内钙离子浓度对两者皆有显著影响。
    实验三
    有研究表明,细胞周期处于G1末期可以显著的增加胞内mRNA的含量,进而提高产物的比生成速率(Du et al., 2015; Ramirez & Mutharasan, 1990; Suzuki & Ollis, 1989, 1990)。为了研究细胞生长抑制和产物比生长速率提高的关系,本小节研究了不同周期细胞所占细胞群的比例。结果如Figure 3所示。
    由Figure 3a可知,对比培养基钠钾比为2的条件,在培养基钠钾比为0.5的条件下,大部分细胞都处于G0/1期。令人感兴趣的是,在培养基加入了CAI的条件下,大部分细胞也处于G0/1期,可以和培养基钠钾比为0.5的条件达到相同的效果。
    由Figure 3b可知,对比培养基钠钾比为2的条件,在其他实验条件下,处于G2/M期的细胞大量减少,所以导致处于G0/1期的细胞大量增加。G0/1期细胞的增加是导致在细胞生长受到抑制时,产物比生成速率增加的原因之一。
    实验四
    本小节研究了在2L搅拌式灌流反应器中,培养基钠钾比为0.5的条件对细胞生长和产物比生成速率的影响。细胞在培养到第10天时,更换成钠钾比为0.5的灌流培养基,结果如Figure 4所示。
    由Figure 4a可知,在培养基钠钾比为0.5和培养基钠钾比为9的条件下,活细胞密度可以稳定在40×106 cell/ml,同时对细胞活率没有显著影响。
由Figure 4b可知,对比培养基钠钾比为9,在培养基钠钾比0.5的条件下,细胞每天比生长速率显著下降。比生长速率的降低可以减少每天培养基的移除量以达到保持细胞密度恒定的目的。并且在培养基钠钾比为0.5的条件下,第22天移除培养液的总体积是培养基钠钾比为9条件下移除培养液总体积的32%,意味着减少培养基的消耗。
    由Figure 4c可知,对比培养基钠钾比为9,在培养基钠钾比为0.5的条件下,产物比生成速率有显著的提升。
    由Figure 4d可知,在培养基钠钾比为0.5和9两种条件下,活细胞密度皆可以稳定在40×106 cells/ml。但是在培养基钠钾比为0.5的条件下,产物比生成速率有着显著的提升,从30 pg/cell/day提升至115 pg/cell/day。而且,较高的产物比生成速率在培养结束之前维持了5天之久,表明在稳定的灌流培养模式下,培养基钠钾比为0.5的条件可以带来持续的收益。
    实验五
    为了验证实验结果是否在其它细胞株上也适用,本小节研究了不同CHO细胞株在培养基钠钾比为0.5条件下,细胞比生长速率和产物比生成速率的差异。这些细胞包括生产不同单克隆抗体、基于谷氨酰胺合成酶系统的CHO-K1细胞和基于二氢叶酸还原酶系统的DG44细胞。结果如Table 1所示。
    由Table 1可知,所有测试细胞株对培养基钠钾比为0.5的培养基皆表现出相同的响应。除了一号细胞株的产物比生成速率是对照组的1.4倍,其他细胞株的产物比生成速率皆是对照组的两倍或者两倍以上。所有细胞株的比生长速率皆降至对照组的0.09。结果表明,在钠钾比为0.5的培养基中,细胞比生长速率降低和产物比生成速率的提高具有普遍适用性。
    实验六
    重组蛋白的翻译后修饰对产品的功效影响显著。一般来说,蛋白的质量属性包括N-糖基化,电荷异构体和分子量大小。本小节研究了不同细胞株在培养基钠钾比为0.5条件下,蛋白质量的差异。其中,尤其关注产物比生成速率达到100 pg/cell/day以上的三号和四号细胞株。因为这两株细胞蛋白表达量较高,很可能会导致蛋白质量的下降。结果如Figure 5,Figure 6所示。
    由Figure 5可知,在培养基钠钾比0.5条件下,不同细胞株蛋白的N-糖基化修饰皆有不同的改变。在培养基钠钾比为0.5条件下,一号细胞株蛋白的高甘露糖型显著高于对照组。并且在较低和较高培养基钠钾比的条件下,其高甘露糖型随时间不断的增加。末端半乳糖和非甲基化糖型没有显著改变。这与三号和四号细胞株恰好相反。在培养基钠钾比为0.5条件下,这两株细胞蛋白的非甲基化糖型显著提升。总之,不同细胞株蛋白糖基化修饰差异较大,所以不同的细胞株应具体分析,没有统一的结论。
    在培养基钠钾比为0.5条件下,一号细胞株蛋白的碱性峰增加,但是三号细胞株蛋白的碱性峰却没由显著增加。同时,在培养基钠钾比为0.5条件下,三号细胞株的蛋白分子量没有显著差异,只是低分子量的有所增加。
    3、讨论
    在灌流培养过程中,培养液的移除是导致产物损失的重要原因之一。所以亟需开发一种方法在保持活细胞密度稳定的基础上,减少培养液的浪费。本研究通过调节培养基钠钾浓度的方法来抑制细胞生长,并且不会改变培养基的渗透压。当钠钾比为0.5时,细胞的生长受到显著的抑制。其中一支细胞株, 其比生长速率降至对照组的9%,总培养液移除量为对照组的50%。这意味着产物生成效率的显著提升。
    大部分细胞的生长被抑制在G0/1期。由于本文使用碘化丙啶法来测定细胞周期,所以根据DNA的含量无法区分G0和G1期。然而,在培养基钠钾比为0.5条件下,细胞的产物比生成速率有显著的增加,说明大部分的细胞被阻滞在了G1期。之前的研究也表明胞外较高钾离子浓度会改变细胞膜电位,导致细胞无法从G1期过渡到S期(Orr et al., 1972; Stambrook et al., 1975)。同时,胞内钙离子浓度液受到抑制,这与钾离子浓度的升高相关。
当考虑整体的蛋白质量时,钠钾的浓度对蛋白质量没有显著的影响。然而,当不同细胞株在不同钠钾比的培养基中培养时,其蛋白质量应视具体情况而定。不过,本文所检测到的蛋白质量的改变大部分还是在能令人接受的范围内。
    zui后,在钠钾比为0.5条件下,五株细胞的产物比生成速率是对照组的1.4~3.9倍。三号和四号细胞株的产物比生成速率分别为115 pg/cell/day和110 pg/cell/day,这说明产物比生成速率有显著的提升。细胞生长受到阻滞不仅可以减少培养液的移除量,而且还可以显著地增加产物的比生成速率,说明培养基开发的重心可以放在如何将细胞生长阻滞在G1期上。通过调节钠钾比来控制细胞生长这种方法是简单而有效的。钠离子和钾离子是几乎所有培养基的共有成分,其安全性也无需做过多的验证。








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